Pull-down下拉實(shí)驗(yàn)

一、技術(shù)簡(jiǎn)介

Pull-down實(shí)驗(yàn)，又稱(chēng)拉下實(shí)驗(yàn)，是一種體外親和純化技術(shù)。

二、技術(shù)原理

將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），但細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)"則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。

三、應(yīng)用場(chǎng)景

1.驗(yàn)證已知蛋白相互作用：通過(guò)將已知的誘餌蛋白與可能相互作用的獵物蛋白進(jìn)行Pull-down實(shí)驗(yàn)，若能檢測(cè)到獵物蛋白的存在，則可驗(yàn)證兩者之間的相互作用關(guān)系。

2.篩選未知蛋白相互作用：將誘餌蛋白與細(xì)胞裂解液或其他蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行Pull-down實(shí)驗(yàn)，然后對(duì)結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，可篩選出與誘餌蛋白相互作用的未知蛋白。

3.研究蛋白質(zhì)復(fù)合物組成：通過(guò)Pull-down實(shí)驗(yàn)分離出蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后對(duì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，可確定蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成成分。

4.研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用：利用DNA Pull-down和RNA Pull-down技術(shù)，可研究蛋白質(zhì)與DNA、RNA之間的相互作用，如轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合、RNA結(jié)合蛋白與RNA的結(jié)合等。

四、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

可以確定目的蛋白和檢測(cè)蛋白是否可以發(fā)生直接相互作用。

五、樣本類(lèi)型

新鮮細(xì)胞（貼壁細(xì)胞/懸浮細(xì)胞）、凍存細(xì)胞、凍存組織、裂解液樣本。

六、樣本需求

細(xì)胞樣本：約5×10^6個(gè)（可以是2個(gè)6cm皿，或以懸浮細(xì)胞形式存儲(chǔ)于離心管中，或2個(gè)T25瓶）；

凍存組織：約40mg；

裂解液樣本：蛋白濃度不低于2mg/mg，蛋白總量不低于3mg。

七、樣本準(zhǔn)備&運(yùn)輸

活細(xì)胞樣本：距離較近的可提供新鮮樣本，將培養(yǎng)在皿/T25瓶/離心管內(nèi)的新鮮細(xì)胞樣本常溫快遞（最遲次日達(dá)）運(yùn)輸，本市內(nèi)可閃送或親自遞送，距離較遠(yuǎn)的，可-80℃凍存細(xì)胞干冰運(yùn)輸；

組織樣本&裂解液樣本：-80℃凍存干冰運(yùn)輸。

八、需提供的試劑

如進(jìn)行WB檢測(cè)，需提供相應(yīng)抗體。

九、實(shí)驗(yàn)周期

3-4周（不包含質(zhì)譜）

十、其他

RNA-Pull-down、DNA-Pull-down、GST-Pull-down，具體需告知種屬及目標(biāo)蛋白，后續(xù)檢測(cè)Western blot/蛋白質(zhì)譜，融合蛋白體外表達(dá)費(fèi)用需根據(jù)具體目標(biāo)蛋白單獨(dú)評(píng)估計(jì)算。

的轉(zhuǎn)錄因子，部分實(shí)驗(yàn)亦可使用重組表達(dá)的蛋白。

六、樣本需求

細(xì)胞樣本：約1×10^7個(gè)（可以是1個(gè)10cm皿，或以懸浮細(xì)胞形式存儲(chǔ)于離心管中，或1個(gè)T75瓶）；

凍存組織：約400mg；

植物組織：約2g；細(xì)胞核蛋白、純化轉(zhuǎn)錄因子、重組表達(dá)蛋白等：每張膜至少提供50ul，濃度不低于0.5mg/ml。

七、樣本準(zhǔn)備&運(yùn)輸

活細(xì)胞樣本：距離較近的可以將養(yǎng)在皿/T75瓶/離心管內(nèi)的新鮮細(xì)胞樣本常溫快遞（最遲次日達(dá)）運(yùn)輸，本市內(nèi)可閃送或親自遞送，距離較遠(yuǎn)的，可-80℃凍存細(xì)胞干冰運(yùn)輸；

組織樣本&其他液體樣本：-80℃凍存干冰運(yùn)輸。

八、需提供的試劑

結(jié)合蛋白特異性抗體50ul以上，濃度大于0.5mg/ml。

九、實(shí)驗(yàn)周期

2-3周

十、其他

探針序列，如無(wú)探針序列，請(qǐng)?zhí)峁〥NA結(jié)合蛋白相關(guān)信息或相關(guān)文獻(xiàn)。